熒光檢測知識普及原理

很多細胞實驗都要檢測熒光，為方便大家選擇合適的方法，在此簡單說一下各種熒光檢測方法的特點。不足的地方，歡迎大家補充：

1、流式，優點是速度快，非常適合做大數量統計，且樣品只被檢測一次，*不用擔心熒光淬滅的問題。缺點是只能檢測熒光的有無、強度大小，無法提供空間定位信息，無法做熒光定位變化的實驗；由于樣品只被檢測一次，因此無法對同一個樣品進行連續觀察。例如，做膜蛋白定位時會得到這么一個結果——用流式可以檢測出信號，但是用顯微鏡卻看不到東西，排除儀器和濾光片選擇問題，很可能是核的自發熒光或非特異標記造成流式的假陽性結果。

2、熒光顯微鏡，剛好與流式互補，可很好地進行空間觀察，判斷目標蛋白的定位，但是不適合做大流量檢測，估計沒人能經得起時間的考驗。有不同倍率的物鏡選擇，可以使用高倍物鏡看精細結構，或用小倍率物鏡做少量統計。與之搭配的CCD和軟件，是系統能否發揮性能的關鍵。尤其是CCD，從那么多商品里選一款合適的不容易，需要了解很多知識否則只能聽別人忽悠。

3、共聚焦，熒光顯微鏡的升級產品，具有很好的光學層切效果，能得到很好三維定位信息。但是，如果使用共聚焦的目的僅僅是為你的樣品拍一張靚照，取得一張好看的圖片，就讓人覺得可惜了。共聚焦基本都是全自動系統，可隨意定義照明區域、選擇多個熒光通路和設定定時取圖，所以，做Time-laps、FRAP和FRET有其獨到的優勢。另外，4Pi和STED又是其中的極，具有超高的空間分辨率，只是使用不方便，未必適合做生物實驗。

4、全內反射，熒光顯微鏡的另一種升級產品，屬于近場光學范疇，只適合且合做膜研究，無法看到胞內信息。也是用CCD成像，但是對CCD的要求更高——個人甚至覺得對CCD的要求是沒有上限的。

5、雙光子，另一種共聚焦，因使用長波激發熒光，故能做深層檢測（突破共聚焦的100微米極限），典型的應用是觀察活體腦組織。巨貴無比，國內沒有幾臺，能用上的人不多——就不說了。

6、新推出的高內涵藥篩系統，流式和顯微鏡的雜合體，使用電動載物臺，可以自動地按預定程序完成實驗，可做大流量檢測（雖然速度慢點），而且有成像能力，可以判斷定位。前段時間，國內哪裝了一臺，很多人在吹，但我實在不知道其中的好處——任何一臺帶電動載物臺的顯微鏡都可以達到相似的效果，只要軟件支持——估計有人賺大發啦！

從以上的簡介可以看出，只要是熒光樣品，就應該都可使用以上儀器檢測（只用TIRF受一些限制）。但是實際應用時，大家可能會碰到某些樣品可以使用流式和顯微鏡，但是無法使用共聚焦。為什么？解釋一下：

首先，熒光檢測必須有激發光照明，染料被特定波長的光照射以后才能發射熒光。激發光源有兩種：1）白光（汞燈、氙燈等），然后通過濾光片選擇只通過特定波長的光。如檢測GFP時，大家能看到藍光照射在樣品上，因為GFP的激發條件是488nm 光。但是有一點，顯微鏡不可能裝無限多的濾光片，所以選擇是有限的。2）激光，普通的激光器只能發射特定波長的光，且數量有限，常見的是405、488、514、543、633等，所以可使用的染料也是有限。因此，大家判定儀器能否滿足你實驗要求，務必先看看激發條件是否合適。

其次，在光檢測器（PMT、CCD)前還有一塊濾光片，作用是反射樣品各種散射光，只通過特定波長的熒光，提高信噪比，得到干凈的背景。因此，這塊濾光片也決定了儀器能否滿足你的實驗要求（不用太擔心，這個一般和激發濾光片配套，不會有太多問題）。而在光譜型共聚焦里，使用的是棱鏡或衍射光柵分光，可以選擇通過任意需要的波段。這對使用量子點做標記的同學特別有好處！